UTILISATION DU SYSTEME CRISPR/CAS9 POUR L'EDITION GENOMIQUE CIBLEE SUR LA PLATEFORME BIOSIT "TRANSGENÈSE POISSONS ZEBRES"

Elisabeth SAMBRONI, Amélie PATINOTE, Jean-Jacques LAREYRE
INRA, UR1037, Laboratoire de Physiologie et Génomique des Poissons (LPGP), F-35042 Rennes cedex, France
 
L’objectif de ce projet était d’acquérir sur la plateforme Biosit « Transgenèse poissons-zèbres » le savoir-faire pour invalider des gènes in vivo avec le système CRISPR/Cas9. Ce système s’appuie sur deux éléments majeurs : un ARN guide capable de s’hybrider sur une séquence spécifique du génome de 16 à 23 pb et une endonucléase Cas9 capable de se lier à l’ARN guide. L’action de l’endonucléase Cas9 fixée par l’ARN guide aboutit à une coupure double brin de l’ADN génomique au niveau de la séquence cible. Si le système de réparation de l’ADN de la cellule ne réussit pas à réparer la coupure de manière conforme, différents types de mutation peuvent alors intervenir au site de coupure (insertion, délétion, mutation ponctuelle…).
 Nous avons utilisé ce système pour invalider, chez le poisson zèbre, le gène fshr qui code pour le récepteur de l’hormone folliculostimuline (Fsh). L’étude des phénotypes engendrés par l’invalidation du gène nous permettra de mieux comprendre le rôle de la voie de signalisation Fsh/Fshr chez les poissons téléostéens. Nous avons choisi de retirer une grande partie de l’exon 10 du gène qui code pour les domaines fonctionnels transmembranaire et intracellulaire du récepteur en utilisant une combinaison de 2 ou 3 ARN guide co-injectés avec un ARN cappé codant pour l’endonucléase Cas9.  Les 4 sites de coupure ont été identifiés à l’aide de l’outil en ligne Zifit (http://zifit.partners.org) et sélectionnés en raison de l’absence de « off-target » prédite. L’ARN Cas9 et une combinaison de 2 ou 3 CRISPR ont été co-injectés dans les embryons de zebrafish au stade une cellule. Les animaux porteurs de la mutation du gène (environ 30 % des animaux injectés) ont été sélectionnés à l’âge de 2 mois par génotypage sur de l’ADN génomique extrait de la nageoire caudale. De manière intéressante, nous avons observé que des délétions différentes ont été générées entre les différents animaux et chez un même animal. Cette dernière observation illustre le chimérisme somatique des animaux injectés. Selon la combinaison d’ARN guide testée, seuls 10 à 50% des animaux pré-sélectionnés par génotypage sur nageoire ont été capables de transmettre la mutation à leur descendance avec des taux variables allant de 1 à 48%. De manière inattendue, tous les descendants F1 ont été porteurs de la même mutation alors que certains parents fondateurs présentaient plusieurs types de mutation majeurs au niveau somatique. Des populations F1 ont pu être générées pour deux familles indépendantes et présentant une délétion légèrement différente au niveau de l’exon 10. Une population F2 a pu être générée par un croisement F1 x F1 avec obtention d’individus hétérozygotes ou homozygotes pour l’allèle muté. L’analyse du sexe-ratio, réalisée pour l’heure sur une seule des deux familles, montre un déséquilibre très important en faveur des femelles chez les animaux F1 porteurs de la mutation (97%) alors que le sexe-ratio est équilibré chez les animaux F1 de génotype sauvage (52%). Le(s) phénotype(s) engendrés par la mutation du gène fshr seront approfondis dans les prochains mois.
En résumé, le système CRISPR/Cas9 permet désormais de générer sur la plateforme BIOSIT des lignées stables de poissons zèbres porteurs d’allèles mutés en moins de 9 mois.
 
(Etude financée par l’AAP BIOSIT 2014, autorisation d’expérimentation animale n° 2015050421325280)
 
Contacts :
Responsable de l’étude : jean-jacques.lareyre@rennes.inra.fr
Responsable scientifique plateforme transgénèse poissons-zèbres : pierre-yves.rescan@rennes.inra.fr